基因敲除方法篩選與人類腫瘤生長和抗藥性相關的基因

【背景】

目前,RNAi技術是篩選哺乳動物細胞基因組功能缺失的一種主要方法。但是RNAi技術只能通過降解mRNA的方法達到抑制基因表達的效果,無法在基因組水平通過敲除基因造成功能缺失。CRISPR-Cas9技術通過sgRNA介導Cas9蛋白,對哺乳動物基因組的特定位點產生插入/缺失的突變,造成其基因功能永久性缺失,有較好的抑制效果。因此構建慢病毒包裝的CRISPR-Cas9的高通量篩選文庫可以實現基因組范圍內的大規模功能基因的篩選。CRISPR-Cas9高通量篩選文庫可廣泛應用于人類腫瘤疾病研究中,系統的分析、驗證一些與腫瘤生長及抗藥性相關基因,篩選與腫瘤疾病治療相關的藥物靶點。

【方法】

  1. 構建單質粒載體(圖1),載體包含了Cas9基因、sgRNA基因以及Puro篩選標記,使用慢病毒包裝轉染細胞(圖2);
  2. 慢病毒包裝單質粒表達載體

  3. 針對人類基因組中18,080個基因的5’外顯子,平均每個基因設計3~4個sgRNA位點,構建含有64,751個sgRNA的文庫(圖2);
  4. sgRNA文庫構建及慢病毒包裝

  5. 為了檢測GeCKO文庫的敲除效果,采用陰性篩選檢測與細胞耐藥性相關的基因;采用陽性篩選檢測與細胞生長或生存相關的基因。
    高通量篩選結果的后期分析采用RIGER算法(圖3)。
  6. CRISPR基因敲除文庫篩選及收集、分析具有篩選表型的細胞

【結論】

  1. 陰性篩選結果顯示,GeCKO文庫篩選到某些與核糖體結構組成的相關的基因對黑色素瘤A375細胞的生長具有重要的作用;
  2. 陽性篩選結果顯示,除了已知的NF1和MED12基因,NF2、CUL3、TADA1和TADA2B這4個基因也參與了威羅菲尼在黑色素瘤A375細胞中的耐藥調節過程。

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參考文獻

  1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7