使用no-SCAR系統完成大腸桿菌的基因組編輯

【背景】

CRISPR-Cas9作為一種應用廣泛的基因組編輯技術可對各物種的基因組進行高效、準確的修飾。Cas9核酸內切酶可以造成DNA雙鏈斷裂,通過同源重組和非同源末端連接兩種途徑對基因組進行修復,實現基因組堿基的缺失或插入,最終完成精準的基因修飾。在大腸桿菌細胞中需要λ-Red系統完成斷裂基因組的修復,因此no-SCAR(Scarless Cas9 Assisted Recombineering)系統使用λ-Red方法促進基因組重組外源DNA和Cas9介導的雙鏈DNA切割對野生型細胞進行選擇,同時質粒系統無需染色體標記。這種no-SCAR系統可以對基因組的多個位點進行點突變、基因刪除和短序列的插入,能夠高效、無痕的一步完成,為微生物基因組研究提供了快速、有效的方法。

【方法】

Cas9質粒系統包含PTET啟動子,控制Cas9基因表達的ssrA標簽和增加負調節表達的tetR啟動子,可以嚴格控制Cas9質粒的轉錄。sgRNA質粒系統包含gam、bet、exo基因,這些基因表達的λ-Red重組系統可以幫助大腸桿菌基因組進行重組。兩個質粒系統包含基因組修飾所需的所有元件,無宿主特異性(圖1)。

Cas9及sgRNA質粒系統組成

【結論】

  1. 構建的Cas9和sgRNA表達質粒包含了大腸桿菌基因組修飾的所有元件,無宿主特異性,可對基因組任何位點進行點突變、基因組敲除/敲入;
  2. ropB基因516位點的錯義點突變對利福平藥物產生抗藥性(圖2);
  3. RopB基因位點突變序列

  4. 利用71bp長度的引物成功刪除了ack基因的1,095bp長度的序列(圖3)
  5. ack基因刪除序列

  6. 在pfkA基因中成功插入79bp長度的ssA標簽(圖4);
  7. pfkA基因插入序列

  8. 將細胞分別在基本培養基和無氯霉素培養基上37℃過夜培養后,克隆細胞只在基本培養基上生長。由此說明,no-SCAR質粒可以在基因組編輯完成后被移除,不會對后續基因組編輯操作造成影響。

CRISPR-Cas9服務訂購

  1. Email:請將您的詳細需求發送到[email protected]
  2. 電話訂購:您可以直接撥打免費熱線4000-973-630轉803聯系我們經驗豐富的工程師
  3. QQ咨詢:任何技術問題均可與我們在線互動,泓迅科技官方企業QQ:4000-973-630
  4. 關注泓迅科技微信公眾號:szhxswkj;按照“姓名+學校/公司名稱+聯系方式”給我們留言,即可免費獲取“CRISPR-Cas9基因編輯技術應用手冊”。

參考文獻

Reisch, C.R. and K.L. Prather, The no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) system for genome editing in Escherichia coli. Sci Rep, 2015(5) :p. 15096.