利用CRISPR RNPs高通量平臺研究人類T細胞中HIV病毒的作用功能研究

【背景】

將體外融合的CRISPR RNPs通過電穿孔的方法,對人體的CD4+ T細胞成功實現基因組編輯。為了了解細胞中HIV病毒和人類宿主細胞之間的相互作用,使用CRISPR RNPs高通量平臺實現對宿主細胞中的候選基因高效有序的編輯。使用這種新的基因工具不僅可以成功實現CD4+ T細胞中的基因編輯,同時還可以實現高效的、成對的基因敲除。CRISPR RNPs高通量平臺最大的優勢是高效、大量、有序的篩選出與某些表型相關的候選基因,該技術能夠促進藥物靶標確認和細胞水平上HIV病毒感染的治療。

【方法】

  1. 編輯人類T細胞中的HIV病毒的宿主因素
  2. 使用96孔板體外合成不同的Cas9 RNPs重組蛋白,并通過電穿孔的方法將其轉入到人類CD4+細胞中可以在一個血液樣本中快速的產生幾百個不同的,轉基因修飾池。
    實驗流程:從人體血液中純化出CD4+ T細胞,在抗CD3/CD28刺激下激活;使用電穿孔法將Cas9 RNPs轉入,在DNA和蛋白水平上檢測基因組編輯情況;這些被編輯過的細胞群體通過多種HIV病毒注射實驗來檢測功能(圖1)。
    使用多重平臺在人類CD+細胞中編輯HIV宿主因素的流程

  3. 確認在人類初級T細胞中的HIV候選依賴因素
  4. 敲除與HIV整合相關的LEDGF基因,設計,6個crRNA用于檢測并確認LEDGF基因敲除對人類T細胞的影響。為了有更明顯的效果,用另外一種感染方式使用效率最高的crRNA對人類初級T細胞進行感染(圖2)。
    對人類初級T細胞進行病毒感染

【結論】

  1. 在DNA水平和蛋白水平證實了Cas9 RNPs成功的對細胞的基因組進行了修飾;
  2. 應用Cas9 RNPs高通量平臺去高效準確的敲除CXCR4和CCR5基因;
  3. 6個crRNA對LEDGF基因敲除結果顯示(圖3和圖4),其中兩個crRNA可以使蛋白表達明顯降低,使用其他感染方式對細胞進行感染后發現,3天后細胞內病毒的復制有2~7倍的降低;7天后,效果更加明顯,細胞內病毒復制有6~12倍的降低;
  4. LEDGF基因蛋白表達量
    LEDGF基因蛋白表達量

  5. TNPO3基因和LEDGF基因敲除后,細胞可以避免病毒感染(圖5)。由此可以證明TNPO3基因和LEDGF基因是HIV病毒的依賴因素;
  6. TNPO3基因和LEDGF基因表達量

  7. 單獨使用Cas9 RNPs敲除CXCR4基因和CD4+基因與同時敲除兩個基因,兩者間基因編輯效率沒有差別(圖6);
  8. CXCR4基因與CD4+基因的基因編輯效率

  9. 同時使用Cas9 RNPs對CXCR4和LEDGF基因進行敲除,結果顯示單獨敲除CXCR4和LEDGF基因或者成對敲除兩個基因之間的效率是相同的(圖7)。由此說明,Cas9 RNPs多重編輯平臺可以高效的一站式對成對的基因進行敲除,與單獨敲除方法相比效率不變;
  10. CXCR4和LEDGF基因進行敲除效率

  11. 使用CRISPR-Cas9 RNPs高通量平臺可以對人類T細胞系統進行篩選及高通量表型分析,因此對已發表的文獻中提到的45個直接或者間接與HIV整合酶相關的基因進行篩選。針對45個基因設計了146個sgRNA,培養48 h時間后使用HIV病毒感染,2~6天后觀察結果發現,CXCR4、CDK9、LEDGF、GEMIN2、KPNA1、KPNA5、KAT2A、FAM96B、UNC45A基因敲除后可以抑制HIV病毒的感染。而SMARCB1、XRCC6基因的敲除導致HIV病毒感染的增強;PLOD1、SUCLA2、HDGFRP2、EEEF1A1四個基因至少在一個個體中成為HIV病毒感染的潛在因素(圖8)。
  12. 高通量平臺對人類T細胞系統的進行篩選及表型分析結果

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參考文獻

Hultquist, J.F., et al., A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells. Cell Rep, 2016.17(5): p. 1438-52.