由dCas9介導的高效的轉錄激活系統
【背景】

CRISPR-Cas9技術可以準確、高效的對基因組特定靶位點進行基因編輯,造成基因的缺失或者插入。不具有切割活性的dCas9仍然可以在sgRNA的介導下準確的靶向基因組DNA,因此設計將dCas9與轉錄增強子進行融合,期望得到的融合蛋白可對基因轉錄具有增效的效果。這種方法為研究基因的轉錄激活調控提供了新的方法。

【方法】

dCas9載體構建方案,后續可融合轉錄激活因子促進轉錄的進行(圖1)。
dCas9載體構建

【結論】

  1. dCas9與轉錄激活因子融合轉錄增強結果顯示,融合三個轉錄激活因子的增強的效果明顯高于融合單個轉錄激活因子(圖2);
  2. 融合轉錄激活因子后的表達情況

  3. 為了確定VPR組成的必要性,將三個轉錄因子中的不同部分用mcherry替換。結果顯示,被mcherry替換后的轉錄增強效果不明顯(圖3),由此說明VRP結構組成對于轉錄激活具有重要作用;
  4. VPR結構組成對增強效果的影響

  5. VPR連接順序是轉錄激活的影響因子,當順序為VP64-p65-Rta時,轉錄激活效果最明顯(圖4);
  6. VPR的連接順序對增強效果的影響

  7. 檢測人類293T細胞中的MIAT、NEUROD1、ASCL1、RHOXF2、TTN、ACTC1基因,結果顯示dCas9結合轉錄增強子對不同的基因激活程度不同(圖5);
  8. dCas9結合轉錄增強子對不同的基因的增強效果

  9. dCas9-VPR在不同的物種中轉錄激活效應有所差別,從7倍到 32,600倍的激活效應(圖6)。
  10. dCas9-VPR在不同的物種中的轉錄激活效應

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參考文獻
Chavez, A., et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods, 2015. 12(4): p. 326-8.